0, p’-DDDの副腎皮質ステロイド合成酵素および 肝におけるステロイド代謝酵素に与える影響
福島県立医科大学第三内科
小 島 元 子,斎 藤 万一郎
伊 藤 信 雄,草 野 良 郎 福 地 総 逸 東北大学医学部第二病理
長 沼 廣
The Effects of o,p’-DDD on Adrenal Steroidogenesis and Hepatic Steroid Metabolism
Motoko OJIMA, Manichiro SAITOH, Nobuo ITOH, Yoshiro KUSANO and Soitsu FUKUCHI The Third Department of Internal Medicine Fukushima Medical College Fukushima, Japan
Hiroshi NAGANUMA Department of Pathology, Tohoku University School of Medicine Sendai, Japan
O,p’-DDD is used for the treatment of adrenocortical carcinoma and Cushing’s disease. The inhibitory effect of this drug on the adrenal steroid biosynthesis has been described by many authors, but there are very few reports about the sites of action of this drug on adrenal steroid synthesis. This paper presents in vitro studies on adrenal steroidogenesis and hepatic steroid metabolism.
The effects of o,p’-DDD on adrenal 36-hydroxysteroid dehydrogenase (36-HSD), 116- hydroxylase (116-OHlase) and 18-hydroxylase (18-OHlase) were examined in vitro using mitochondrial and microsomal fractions prepared by standard centrifugation procedures from the homogenate of bovine adrenal cortices. The concentrations of o, p’-DDD inducing 50% inhibition of 36-HSD, 116-OHlase and 18-OHlase were 8 X 10 M, 1 X 10-5M and 3 X 10-6 M, respectively. This study clearly demonstrates the marked inhibitory effects of o,p’- DDD on 36-HSD in vitro, which was not described previously. The inhibitory effects of o,p’-DDD on these 3 enzymes were diminished by an addition of 0.05 ~ 0.5 mM of co- factor (NADPH or NAD). The results indicate that o,p’-DDD may reduce NADPH or NAD
第61巻 第3号
utilization, resulting in the inhibition of steroidogenesis.
The effects of o,p’-DDD on hepatic 56-reductase were examined in vitro using rat liver homogenate. O,p’-DDD inhibits 56-reductase, resulting in the decrease of conversion of cortisol to dihydrocortisol and tetrahydrocortisol at the concentration of 10-3M.
緒 言
0,p’-DDD が副腎癌の治療に用いられるようになってから,20年以上経過した 。本邦でも,木 1) 野内らは,Cushing 症候群と副腎癌患者46例に本剤を投与した治療成績を集計し、約66%に有用で あったと報告した 。 12)
O, p’-DDD は、副腎皮質細胞に対する選択的細胞毒作用 とステロイド合成阻害作用 を有 11) 4) 8) 9) すると言われている。しかし、本剤自体にはステロイド合成阻害作用はなく、末梢における代謝産 物がステロイド阻害を示すのではないかとする研究者もおり 、本剤の作用ならびに作用機序の詳 17) 細は,いまだ不明である。
今回,副腎皮質細胞分画を用いる in vitro の実験系で, o, p’-DDD のステロイド合成酵素系にお よぼす影響ならびに肝におけるステロイド代謝酵素系に与える作用を検討し、興味深い成績を得た ので、報告する。
実験材料ならびに方法
1) 副腎皮質におけるステロイド合成酵素系の検討
(1)副腎皮質細胞分画の採取方法
実験材料としたのは、3 歳前後の去勢雄ウシの副腎117頭分である。ミートプラントで銃殺·断頭 後,20~30分内に取り出された副腎を氷冷し、迅速に実験室へ運んだ。
副腎皮質のミトコンドリア分画ならびにミクロソーム分画の採取方法は、それぞれ Cammer ら, 5) Chasalow ら に従った。ただ、細胞膜片や,他成分の混入を少なくするため、超遠心の速度を多 6) 少変更した。すなわち,ウシ副腎皮質の束·網状帯組織をメスで細切後,0.25Mのショ糖を含む10 mM の Tris-HCl buffer 中でhomogenize し,600 Gで遠心して核分画を除き,上清を5,000Gで遠心 した沈渣をミトコンドリア分画とした。この上清を12,000Gで30分間遠心して小型ミトコンドリア やライソソームを除き、その上清に CaCl2 を10mM となるように添加して12,000 Gで遠心した沈渣 をミクロソーム分画とした。なお、ミトコンドリア分画を採取後,再び0.25Mのショ糖を含む10 mM の Tris-HCl buffer に浮遊させ,5,000Gで10分画遠心する操作を2回繰り返し,ミクロソー ムや細胞膜片の混入を少なくした。
(2) 副腎皮質細胞分画の incubation 方法
前述の方法で得たミクロソームならびにミトコンドリア分画を10mMのTris-HCl buffer に浮遊 させ、その一部について Lowry らの変法 により,タンパク濃度を測定した。 13)
a) ミクロソーム分画の incubation
16)
ミクロソーム分画については, Potts らの方法 に準じ, 12mM の NaCl, 15mMのKC1, 70mM のショ糖および8.0μMの pregnenolone を含む0.05M の phosphate buffer (pH7.4)を用い,タンパ ク濃度が0.13mg/ml となるように希釈した。既報 のように、このミクロソーム希釈液0.5ml をバ 14)
イアルに入れ、更に基質として 7-3 H-pregnenolone(specific activity; 19.3Ci/mmo l) を 1 μCi 加え、大気下に37℃で振盪しながら30分間 incubate した。
b) ミトコンドリア分画の incubation
ミトコンドリア分画は、長谷川らの方法 に従い,15.4mM の KC1,70mM のショ糖,10mM の 10) sodium succinate を含む20mM の Tris-HCl buffer で希釈し,タンパク濃度が0.2mg/ml および8 mg/ml となるように調整した。タンパク濃度0.2mg/ml 溶液0.5mlに,基質として1, 2-3H-DOC (specific activity; 55Ci/mmol) を1μCi 加え,ミクロソームと同様の条件下に30分間 incubate し た。また,タンパク濃度8.0mg/ml の溶液に,基質として 1, 2-3H-corticosterone(specific activity; 50Ci/mmol) を 1μCi 加え, incubate した。
(3) O, p’-DDDの添加方法
0, p’-DDD は, methanol に溶け易く、水に難溶である。そこで, ミクロソームあるいはミトコ ンドリア分画の incubation buffer 0.5ml に, o, p’-DDD の methanol 溶液 20μl を加えると10-3 M の濃度となるように高濃度溶液を調整した。これを更に methanol で10倍数希釈して10-4~10-9 M の濃度の溶液を作製した。
(4) 反応物の抽出·分離·同定
ミクロソームおよびミトコンドリア分画とも,incubation 終了後, methanol を加えて反応を止め, buffer の10倍容量のdichloromethane で抽出し,discard layer を吸引除去後,減圧乾固した。残渣 14) を silica gel chromatogram sheet に apply し,既報 のように,ミクロソームは, benzene, ace- tone, ethyl acetate, 60 : 10: 10,ミトコンドリア分画は, toluene, methanol,90 : 10の溶媒で展 開し, thin layer chromatogram (TLC) scanner でスキャンして,トリチウム標識ステロイドから 転換·生成されたステロイドを検出した。
(5) 転換率ならびに阻害率の算出方法
a) ミクロソーム分画における pregnenolone から progesterone への転換
2)
Bjorkhem らの方法 に従い,上述のようにして検出した基質である3 H-pregnenolone と,生成 物である3 H-progesterone 分画を methanol でelute し,その一部を液体シンチレーションカウンタ ーで計測した。各計測値を各放射活性より計算した回収率により補正し、最初に添加した 3 H-pre- gnenolone の量で割って pregnenolone から progesterone への転換率を算出した。
ついで,各濃度の o, p’-DDD を添加後の progesterone への転換率を算出し,対照時の値に対す る百分率をとり,本剤の阻害率とした。
b) ミトコンドリアにおける DOCから corticosterone および corticosterone か ら 18-hydroxycor- ticosterone への転換
14)
既報 のように,ミトコンドリア分画のタンパク濃度を0.2mg/ml とし,3 H-DOC を加えて incu- bate すると corticosterone (B) が生成される。また,タンパク濃度を8mg/ml として3 H-B を 加え incubate すると18-hydroxycorticosterone (18-OH-B) が生成される。前項と同様にして, o, p’ -DDD のBへの転換および18-OH-Bへの転換の阻害率を算出した。
2) 肝におけるステロイド代謝酵素系の検討
(1) 肝 homogenate の作製法と incubation 方法
材料としたのは、 Wistar 系雄ラット 7匹の肝臓である。ネンブタール麻酔下に断頭後直ちに取り 出した肝臓に0.25Mのショ糖を含む Krebs-Ringer bicarbonate buffer を10倍容量加え,homoge-
(a)
Microsomal protein 0.13 mg Incubation 2.5 min
P
Microsomal
protein 0.13 mg
4 - P
=
Incubation
5 min
P
P
Microsomal protein 0.13 mg
Incubation 20 min
P
P
5 P-P: pregnenolone P: progesterone
| Microsomal | |||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| protein | 0.13 | mg | A - P | ||||||||||
| Incubation | 10 | min | |||||||||||
| 1ª | |||||||||||||
| P | |||||||||||||
| Microsomal protein | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.13 mg | ||||||||||||
| Incubation | 30 min | |||||||||||
| P | ||||||||||||
| 45- | P | |||||||||||
(b)
100
Percent of inhibition of 36-hydroxysteroid dehydrogenation
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
-7
10
-6
1
10
-5
-4
104
-3
10
Concentration of o,p’-DDD (M)
(a) Thin-layer radiochromatogram
(b) Percent inhibition
0,p’-DDD の副腎皮質ステロイド合成酵素および 肝におけるステロイド代謝酵素に与える影響(小島,他5名)
nizeした。Homogenate に,基質として1, 2-3H-cortisol (F)(specific activity :50Ci/mmol) を加え,37℃で大気下に30分間 incubate した。なお, incubation の際に10-3~10-9 Mの o, p’-DDD を加え、その影響を検討した。
(2) 反応物の抽出·分離·同定
Incubation 後,10倍容量のdichloromethane で抽出し,アルカリ洗浄した後、減圧乾固した。残 渣を, silica gel chromatogram sheet に apply L, benzene, ethyl acetate, methanol, 水, 10: 2 : 5 : 5 の溶媒で展開した。これを TLC scanner でスキャンして,3 H-Fから転換される cortico- sterone (E), dihydrocortisol (DHF) および tetrahydrocortisol (THF)を検出した。なお,今回 用いた溶媒系では,DHF と THF の分離が困難であった。
(3) 転換率ならびに阻害率の算出方法
副腎のミクロソームおよびミトコンドリア分画の incubation 時と同様に,3 H-F から転換された各 ステロイド分画を methanol でelute 後,転換率ならびに o, p’ -DDD の転換阻害率を算出した。
成 績
1) O, p’-DDD の副腎皮質 ミクロソーム分画におけるステロイド生成におよぼす影響
14)
すでに,著者ら は、ミクロソーム分画に 3 H-pregnenolone を添加して incubate すると proge- sterone が生成され,本分画に 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase with △4→5isomerase (以下 3 β- HSD と略)が存在することを証明した。
O,p’ -DDD を10-9 M添加すると, TLC scanning gram 上,対照時に比べて progesterone のピー クが小さくなり,本剤10-3 M添加時には, progesterone のピークは著しく小さくなった(Fig. 1)。 3β-HSD を50%阻害する本剤の濃度は,8×10-6 Mであった(Table 1)。
| Enzyme system | Concentration of o,p'-DDD (M) |
|---|---|
| 3B-HSD | 8.0×10-6 |
| 110-OHlase | 1.1×10-5 |
| 18-OHlase | 3.5×10-6 |
2) O, p’-DDD の副腎皮質 ミトコンドリア分画におけるステロイド生成におよぼす影響
(1) 11 β-Hydroxylationにおよぼす影響
14)
既報 のように,ミトコンドリアのタンパク濃度を0.2mg/ml として,3H-DOC を加えて incu- bateすると,Bが生成されることから、本分画には11β-hydroxylase が存在する。
同条件下に,10-9~10-3 Mの o, p’ -DDD を添加すると,10-7 MからBへの転換が抑制され, 10-6 M以上の濃度では, dose-related に抑制された(Fig. 2)。この11β-hydroxylation を50%阻害する 本剤の濃度は,1.1×10-5 Mであった(Table 1)。
第61巻 第3号
100
% Inhibition of 116-hydroxylation
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
9
10
8
10
-7
10
-6
10
-5
10
4
10
3
100
% Inhibition of 18-hydroxylation
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
9
10
8
10
7
10
6
10
5
10
4
10
3
(2) 18-Hydroxylation におよぼす影響
ミトコンドリアのタンパク濃度を8mg/ml として3 H-B を加えて incubate すると, 18-OH-B が
生成される。Incubation の際に10-910-3 Mの o, p’- DDD を加えると,18-OH-Bへの転換率が減
少し, 10-710-4 Mの間では, dose-relatedに抑制された(Fig. 3)。この18-hydroxylation を50%
阻害する o, p’- DDD の濃度は,3×10-6 Mであった(Table 1)。
第61巻 第3号
90
o,p’-DDD 103 M
80
Percent inhibition
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0.05
1.0
NAD (mM)
(a)
(b)
Percent inhibition of 11B-hydroxylase
100
O,p’-DDD
Percent inhibition of 18-hydroxylase
100
90
10- м
90
O,p’-DDD 103 M
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
☐
0
0.1
0.5
0
0.1
0.5
NADPH (mM)
NADPH (mM)
(a) 116-hydroxylation
(b) 18-hydroxylation
3) O, p’-DDD の副腎皮質におけるステロイド合成阻害に及ぼす補酵素の影響
ミクロソーム分画の incubation の際に,10-3 Mの o, p’-DDD と同時に 0.05 mMあるいは1.0mM の NAD を添加して3 H-pregnenolone から 3 H-progesterone への転換におよぼす影響を検討した。 NAD を添加しない場合の progesterone への転換の阻害率は84%であったが,NAD を 0.05mM添 加時の阻害率は7%に減少し,同剤を0.1mM添加時には,転換の阻害は全く認められなくなった (Fig. 4 ).
ミトコンドリア分画の incubation の際に,10-3 Mの o, p’- DDD と同時に0.1mMの NADPH を添 加すると,DOC から Bへの転換の阻害率が減少した。すなわち, NADPH を0.5mM添加すると,転 換の阻害は全く認められなくなった(Fig. 5-a)。同様に,10-3 Mの o, p’-DDD とともに0.1, 0.5 あるいは1.0mMの NADPH を加えて incubate すると、本剤0.5mM以上では,B から18-OH-Bへ の転換が阻害されなくなった(Fig.5-b)。
4) O, p’-DDD の肝におけるステロイド代謝におよぼす作用
ラットの肝 homogenate に 3 H-F を加えて30分間 incubate すると, cortisone (E)と DHF および THF が生成される(Fig.6-上段)。同条件下に10-3 Mの o, p’ - DDD を添加して incubate すると, TLC scanning gram 上,DHF あるいは THF のピークが小さくなり,Eのピークも若干小さくな った(Fig.6-下段)。
各分画を elute して, o, p’- DDD による阻害率を算出すると、本剤の添加による DHF あるいは THF への阻害率は62.1%であった。また,Eへの転換の阻害は,10%であった。
O,P’-DDD
OM
F
THE DHF
E
粉
P-DDD 10”
M
F
THF DHF
E
考 案
副腎癌患者に o, p’ - DDD を投与すると,直後から尿中17-OHCS および17-KS が減少するため, 本剤にステロイド合成阻害作用があると推測される。しかし、本剤がステロイド合成酵素のいかな る部位に作用するのか、またその有効量はどれ位なのかの点について検討した報告は少なく、これ まで, 11β-hydroxylase の阻害 ,あるいは cholesterol 側鎖切断酵素を阻害する成績 が報告され たにすぎない。著者らは、最近, o, p’- DDD を副腎癌あるいは Cushing 病患者に投与して、本剤に 副腎皮質の3 β-HSD, 11β-hydroxylase および21 α-hydroxylase の阻害作用があるという成績を発 表した。
しかし、本剤には副腎皮質におけるステロイド合成酵素を阻害する作用はないとする報告があ る 。すなわち, o, p’-DDD 自体にはステロイド阻害作用はなく、末梢での代謝産物がステロイド 合成を阻害するのではないかという説である。
この点を明らかにするため、著者らは、今回,ウシ副腎皮質の subcellular 分画を用い, 0, p’ -
DDD にステロイド合成阻害作用があるか否かを検討した。これにより, o, p’-DDD には副腎皮質ミ
クロソーム分画の3β-hydroxysteroid dehydrogenation,ミトコンドリア分画の11β-hydroxylat-
ion および18-hydroxylation の阻害作用のあることを直接証明した。また, o, p’-DDD がこれら3種
のステロイド合成を阻害する作用は, dose-related であった。すなわち, 3 β-hydroxysteroid de-
hydrogenation は10-710-3 M, 11β-hydroxylation は10-610-4 M, 18-hydroxylation は 10-7~
10-4 Mの間で, o, p’-DDD 濃度と阻害率の間に,正比例関係が認められた。0, p’-DDD が 3 β-hy-
droxysteroid dehydrogenation, 11β-hydroxylation および18-hydroxylation を50%阻害する濃度
は、それぞれ8.0×10-6 M,1.1×10-5 M,3.5×10-6 Mであった。この結果から, o, p’-DDD が一番
強く阻害するのは, 3β-hydroxysteroid dehydrogenation, ついで18-hydroxylation, 11β-hydro-
xylation であると判明した。
O, p’-DDD がどのような機序でステロイドの合成を阻害するかは不明であるが, ステロイドの水 酸化に必要な補酵素である NADPH (TPNH)の生成あるいは利用を阻害するという報告がある。 今回,ミトコンドリア分画の incubation の際に,その11β-hydroxylation および18-hydroxylation を完全に阻害する10-3 Mの o, p’-DDD とともに,0.1mMの NADPH を加えると、両水酸化の阻害 率が減少した。また,0.5mM以上の NADPH を添加すると, o, p’ -DDD による11β-hydroxylation および18-hydroxylation の阻害が認められなくなった。更に,ミクロソーム分画の incubation の際 に, 10-3 Mの o, p’-DDD とともに0.05mMの NAD を添加すると, 3 β-hydroxysteroid dehydrog- enation の阻害率が減少し,NAD を0.1mM添加すると、転換の阻害が全く認められなくなった。 これらの成績から, o, p’-DDD は,ステロイドの水酸化および脱水素反応の際の補酵素の利用を阻 害すると言える。なお、前述のように, o, p’- DDD が一番強く阻害するのは 3 β-HSD であること から,本剤は,NADPH よりも NAD の利用を強く阻害する可能性が考えられる。
以上のように, o, p’-DDD は、正常副腎皮質や副腎癌におけるステロイド合成を阻害する他,肝
3) 7) におけるステロイド代謝に影響を与えるとする報告 がある。すなわち, Cushing 病患者に o, p’ - DDD を投与すると,血漿Fがほとんど減少しない時期に尿中17-OHCS が減少する。Bledsoe ら は、尿中ステロイドの測定から, o, p’-DDD投与後,F のかなりの量が 6β-hydroxycortisol に転 換されるため,THF および tetrahydrocortisone の尿中排泄量が減少し,17-OHCS の減少をきた すことを明らかにした。この結果から、彼らは, o, p’-DDD が肝における F の 6位の水酸化に影響
する可能性を指摘した 。著者らは, o, p’-DDD 添加後,Fから DHF および THFへの転換が減少 する成績が得られたことから、本剤に 5 β-reductase を阻害する作用のあることを明らかにした。
今回著者らが得た成績のうち, o, p’-DDD に 3β-HSD, 18-hydroxylase の阻害作用のあること, ならびに肝における5β-reductase の阻害作用のあることを見い出した事は、新しい知見である。 従って、本剤は,ステロイド分泌過剰症の治療に有用である。また,F過剰症に本剤を投与する場 合,尿中17-OHCS の減少を認めても,即,F の分泌量の減少とは言えない。
結 語
ウシ副腎皮質のミトコンドリアおよびミクロソーム分画を用いた in vitro の実験系で, 0, p’ - DDD のステロイド合成酵素系におよぼす作用を検討した。O, p’- DDD は,
(1) 3β-hydroxysteroid dehydrogenase の作用を阻害する。本酵素を50%阻害する濃度は,8 × 10-6 Mであった。
(2) 11β-hydroxylase の作用を阻害する。本酵素を50%阻害する濃度は,1.1 ×10-5 Mであった。
(3) 18-hydroxylase の作用を阻害する。本酵を50%阻害する濃度は,3.5 ×10-6 Mであった。 すなわち, o, p’- DDD は, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase を最も強く阻害し、ついで18-hyd- roxylase, 11β-hydroxylase を阻害する。本剤に, 3 β-hydroxysteroid dehydrogenase の阻害作用 のあることを明らかにしたのは、本研究が初めてである。なお、これらの酵素の阻害作用は,補酵 素の添加により回復したことから、その作用機序として、補酵素の利用を阻害する可能性が強く考 えられる。
また, ラット肝 homogenate における in vitro の実験で, o, p’-DDD に 5β-reductase 阻害作用 のあることをはじめて証明した。
0, p’-DDD をご提供下さいました日本ルセル株式会社に感謝いたします。
本論文の一部は, 7 th International Congress of Endocrinology (1984年7月, Quebec, Canada) ada)で発表した。
文 献
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