ヒト正常副腎および副腎腫瘍組織における progesterone 結合蛋白の発現
市立札幌病院泌尿器科
出村 孝義 渡井 至彦 富樫 正樹 大橋 伸生 市立札幌病院腎移植科 力 石 辰 也 平 野 哲 夫 北海道大学医学部泌尿器科教室
野々村 克 也 小 柳 知 彦
EXPRESSION OF PROGESTERONE-BINDING PROTEIN IN NORMAL AND NEOPLASTIC HUMAN ADRENALS
Takayoshi Demura, Yoshihiko Watarai, Masaki Togashi and Nobuo Ohashi Department of Urology, Sapporo City General Hospital Tatsuya Chikaraishi and Tetsuo Hirano Department of Renal Transplantation, Sapporo City General Hospital Katsuya Nonomura and Tomohiko Koyanagi
Department of Urology, Hokkaido University School of Medicine
Specific progesterone-binding protein (P4-BP) is demonstrated in adrenocortical nuclei of the guinea pig, but, not in nuclei of other animals. We tried to demonstrate the progesterone-binding activity in nuclei of human normal adrenals and adrenal tumors. Normal adrenals were obtained from six patients with renal cell carcinomas undergoing radical nephrectomy. Seven adrenocortical adenomas were obtained: five tumors from patients with Cushing’s syndrome, one tumor from non- functioning adenoma, and one from aldosteronoma. Nuclei were purified from the tissues, and progesterone binding assay was performed.
We could not demonstrated progesterone-binding activity in nuclei of six normal human adrenals. However, we demonstrated progesterone-binding activity in nuclei purified from human adrenocor- tical adenomas associated with Cushing’s syndrome. Saturation analysis revealed a Kd of 13.85 ±1.99 nM (mean ± SD, n=5) and a binding capacity of 1.95 ± 0.37 pmol/mg DNA (mean ± SD, n=5). A Kd of progesterone-binding activity in human adrenocortical adenoma was similar to that of guinea pig P4-BP, and a binding capacity was about one-fifteenth of guinea pig P4-BP. However, nuclei purified from a non-functioning adrenocortical adenoma and an aldosteronoma failed to demonstrate progesterone-binding activity. The binding activity was specific for progesterone. 5a-pregnane-3,20- dione was a modest competitor, while, 178-estradiol, testosterone, cortisol, and other related steroids were poor competitors. Thus the progesterone-binding activity in human adrenals was similar to guinea pig P4-BP in the affinity and specificity of binding. Furthermore, we demonstrated [3H] progesterone bound to nuclei from normal human adrenals, as well as, from adrenocortical adenomas associated with Cushing’s syndrome by means of thin layer chromatography. It is possible that the progesterone-binding activity is too low to be detected by the classical steroid binding assay.
Key words: human normal adrenal, adrenal tumor, progesterone-binding-protein
要旨:我々はヒト副腎組織に guiena pig 副腎皮質で見いだされた progesterone 結合蛋白(P4-BP)と同 様な蛋白が局在していないか確かめるため,正常副腎および各種副腎腫瘍の核の progesterone 結合活性
を検討した. ヒト副腎から核分画を調製し, steroid binding assay 法により副腎核中の progesterone 結 合活性を測定した. 6例の正常副腎組織中には progesterone の高親和性結合は認められなかったが, ACTH 非依存性に steroidogenesis が亢進していた 5 例の Cushing 症候群患者から採取した副腎腺腫 組織中には全例結合活性を認めた(Kd=13.85±1.99nM (mean±SD), Bmax=1.95±0.37pmol/mg DNA (mean±SD)). しかし,内分泌非活性副腎腺腫や原発性アルドステロン症を呈する副腎腺腫では progesterone 結合活性は同定できなかった。 結合活性は progesterone に特異的であり, 5α-pregnane-3, 20-dione は中等度の競合阻害を示したが, 17β-estradiol, testosterone, cortisol やその他のステロイド は弱い競合阻害しか示さなかった。 以上より,ヒト副腎組織の核には guinea pig 副腎皮質の P4-BP と同 様の解離定数と特異性を有する progesterone 結合活性が存在することが判明した. 薄層クロマトグラ フィーによりクッシング症候群を呈する副腎腺腫だけでなく正常ヒト副腎組織の核にも 〔3H〕 proges- terone が結合する事から,ヒト正常副腎組織においては progesterone 結合活性が非常に低いため通常 の steroid binding assay 法では同定されない可能性がある.
キーワード:ヒト副腎,副腎腫瘍,プロゲステロン結合蛋白
緒 言
Guinea pig 副腎皮質の核にはprogesterone と特異 的に結合する progesterone-binding protein (P4-BP) が存在するりが,その生理学的機能については未だ不 明である. P4-BP は DNA に結合する事から classical なステロイド·レセプターのように転写調節因子では ないかと推測されており2),また, ACTH により増加 する事から guinea pig 副腎でのステロイド合成に何 らかの働きをしている事が推察されている3).しかし, guinea pig 以外の動物(rat, dog, pig, rhesus monkey, chinchilla-guinea pig に最も近いとされている動物) の副腎組織中に P4-BP は同定されなかった1. 我々は ヒトの正常副腎および各種疾患を呈する副腎について progesterone 結合活性を測定し,副腎組織における progesterone 結合蛋白の機能について若干の考察を 加えた.
材料と方法
1) 組織
正常副腎は 6 例の 腎癌患 者 に対 し radical ne- phrectomy を施行した際に採取した。 また,5 例の副 腎腺腫によるクッシング症候群の患者に対し副腎全摘 術を行い,副腎腺腫組織を採取した.全例,血中ACTH は抑制されており,血中 cortisol は高値を示し,血中 cortisol の日内リズムは消失していた. また、デキサメ サゾン抑制試験で抑制されず、副腎シンチグラフィー で対側副腎は抑制されていた. また, 1 例の内分泌非 活性副腎腺腫と1例の原発性アルドステロン症の副腎 腺腫組織を採取した.
2) 核分画の調製
組織は氷冷にて保存し,6時間以内に既に報告した
方法で1)核分画の調製を行った。 すなわち,副腎組織は 周囲の脂肪や線維組織を取り除いた後,重量を測定し, 4 倍量のバッファーA(20mM Tris-HCl, 1mM Mg acetate, 0.25M sucrose, 1mM phenylmetylsulfony1- fluoride (PMSF), pH 7.4) 中でホモジナイズした. ホモジネートは800×gで10分間遠沈し,沈渣を0.1% Triton X-100を含むバッファーB (50mM Tris-HCl, 5mM Mg acetate, 0.25M sucrose, 1mM PMSF, pH 7.4)に溶解し,10分間放置した後,800×g で10分 間遠沈した. 沈渣を再びバッファーBに溶解し, 4枚 重ねのチーズクロースに通し, 800×g で10分間遠沈し た. 沈渣を20ml のバッファーBに溶解し, 5ml の1.8M sucrose を 含 むバッファーB の上に重層した後, 74,000×g で30分間遠沈した. チューブの底に集まっ た核分画をバッファーC (50mM Tris-HCI, 1.5mM EDTA, 0.25M sucrose, 1ml PMSF, pH 7.4) に溶 解した. バッファーCで2回洗浄した後,核分画は直ち に progesterone binding assay に使用するか、または, 核保存用バッファー(10mM Tris-HCl, 0.2mM Mg acetate, 0.25M sucrose, 20%glycerol(v/v), pH 7.4) に溶解してー80℃にて使用時まで保存した.
3) Progesterone binding assay
既に報告した方法1)で progosterone binding assay を行った。 すなわち、精製した核浮遊液(400μl)と 10~0.625nM 〔3H〕 progesterone を4℃で一晩イン キュベートした. 非特異的結合を測定するため1,000倍 の非標識 progesterone を加えて同様な実験を行った. インキュベートした後、サンプルは3,500rpm で10分 間遠沈し,沈渣をさらに3回バッファーCで洗浄した. 最終的に得られた沈渣にエタノールを1ml加えて室温
にて30分間標識ステロイドを抽出し, エタノール抽出 物に5ml の液体シンチレーター(ACSII,アマーシャ ム社製)を加えて放射活性を測定した. Scatchard 解析 により,解離定数(Kd)と結合数(Bmax)を求めた. DNA の測定は Buron 法4)により行った.
4) 競合阻害試験
ステロイド結合の特異性を調べるために各種ステロ イドによる競合阻害試験を行った. クッシング症候群 を呈する副腎腺腫組織から調製した核浮遊液 (400μl) に10nM 〔3H〕 progesterone 単独または10nM~10μM の非標識ステロイドと共に4℃で一晩インキュベート した. Progesterone binding assay と 同様 にバッ ファーCで3回洗浄後,沈渣中の放射活性を測定した. 〔3H〕 progesterone の核への結合を50%抑制する各種 ステロイドの濃度を測定し, 50%抑制に必要な progesterose の濃度と各種ステロイドの濃度の比率 (%) をそのステロイドの relative binding affinity (RBA) として求めた5).
5) 薄層クロマトグラフィー(TLC)
核に取り込まれた放射活性物質が 〔3H〕 progester- one である事を確かめるため核に結合したステロイド をエタノールで抽出し,既に報告した方法1)で TLC プ レート (J.T. Baker Chemical 社の7010-Si250F ·PA (19C))にかけて分析した. 薄層プレートは benzene- ethylacetate (7 : 3)で展開し,乾燥後,均等に分割 したシリカゲルをプレートからかき取り,液体シンチ レーター(ACS II) を加えて放射活性を測定した.
結 果
1) 正常副腎,および副腎腫瘍組織中の progester- one 結合活性
5例の正常副腎の核には全例progesterone の高親 和性結合は認められなかった(Fig. 1). また,内分泌 非活性副腎腺腫やアルドステロン産生副腎腺腫の核に も progesterone の高親和性結合は認められなかった (Fig. 2), しかし,5例のクッシング症候群の患者から 採取した副腎腺腫の核には全例progesterone の高親 和性結合が認められた. 典型的な症例の Scatchard 解 析の結果を Fig. 3に示し,saturation 解析の結果を Fig. 4 に示す. 5 例の平均 Kd は13.85±1.99nM (mean±SD) で,平均 Bmaxは1.95±0.37pmol/mg DNA であった(Table 1).
2) 結合特異性
クッシング症候群を呈する副腎腺腫から調製した核 分画を用いて progesterone の結合特異性を検討し,そ の 結 果 を Fig. 5 と Table 2 に 示 し た. 副 腎 核 と progesterone の 結 合 は progesterone に 特 異 的 で あ り, 5α-pregnane-3, 20-dione は中等度の抑制(proges- terone の5 分の1 の競合阻害) を示したが, pregnenolone, cortisol, testosterone, estradiol (7) 常に弱い競合阻害しか示さなかった(Table 2).
4) TLC による副腎核に結合した標識ステロイドの 分析
クッシング症候群の副腎腺腫から調製した核に結合 した標識ステロイドを TLC で分析すると、ほとんど
A
B
0.02
0.02
B/F
B/F
0.01
0.01
0.2
0.4
0.2
0.4
B (nM)
B (nM)
A
0.02
B
0.06
0.04
B/F
B/F
0.01
0.02
0.05
0.10
0.15
0.2
0.4
B (nM)
B (nM)
A
0.04
B/F
0.02
0.2
0.4
0.6
B (nM)
(A)Kd=10.11nM, Bmax=2.11pmol/mg DNA.(B)Kd=15.72nM, Bmax=2.22 pmol/mg DNA.
が 〔3H〕 progesterone であり,1,000倍 の非標識 progesterone により抑制された(Fig. 6A). また,正 常副腎から調製した核に結合した標識ステロイドを TLC にかけるとクッシング症候群の副腎腺腫と同様 〔3H〕progesterone の結合が認められ、クッシング症候
0.02
B
B/F
0.01
0.1
0.2
B (nM)
群の場合に比べて抑制率は低いものの,1,000倍の非標 識progesterone により結合抑制が認められた(Fig. 6 B).
考 察
副腎皮質ではグルココルチコイドやミネラルコルチ
15
Total Binding
10
cpm ×10-3
Non-Specific Binding
5
Specific Binding
5
10
(nM)
| 症 例 | Kd(nM) | Bmax (pmol/mgDNA) |
|---|---|---|
| 1 | 15.72 | 2.22 |
| 2 | 10.11 | 2.11 |
| 3 | 14.04 | 2.07 |
| 4 | 15.32 | 1.21 |
| 5 | 14.04 | 2.15 |
| Mean±SD(n=5) | 13.85±1.99 | 1.95±0.37 |
11-Deoxycortisol
[3H] PROGESTERONE BOUND (%)
100-
A
Cortisol
17 B-Estradiol
80
O
60
Testosterone
40-
Deoxycorticosterone
20-
5 a-Pregnane-3. 20-dione
5 B-Pregnane-3.20-dione
0
Progesterone
1
10
100
1,000
FOLD EXCESS UNLABELED STEROID ADDED
| Competitor | Relative binding affinity(×100)ª |
|---|---|
| Progesterone | 100 |
| 5a-Pregnane-3, 20-dione | 20.0 |
| 56-Pregnane-3, 20-dione | 8.6 |
| Deoxycorticosterone | 1.7 |
| Testosterone | 0.7 |
| Pregnenolone | <0.5 |
| 11-Deoxycortisol | <0.5 |
| Cortisol | <0.5 |
| 178-Estradiol | <0.5 |
a Relative binding affinity は [‘H] progesterone の結合を 50%抑制する非標識 progesterone の濃度と各種ステロイ ドの濃度の比率(%)と定義される.
Fig. 6 クッシング症候群を呈する副腎皮質腺腫核 (A) および正常副腎核(B)に結合したステロイド の TLC による分析.
● : 核分画と10nM 〔3H〕 progesterone を 4℃ で一晩インキュベート後,核に結合したステロイド を TLC にかけた. 〇·〇: 核分画と10nM 〔3H〕 progesterone+10μM 非 標 識 progesterone を 4℃ で一晩インキュベート後,同様に TLC にかけた.
15
A
PROGESTERONE
15
4
B
PROGESTERONE
1
10-
10-
cpm ×10-3
cpm ×10-3
5-
1
5.
0
0
3
5
10
15
5
10
15
FPACTION NUMBER
コイドが産生されているが, その他にもエストロゲン やアンドロゲン,プロゲステロンも産生されてい る67). 副腎皮質内での steroidogenesis の機序につい ては未だに不明な点が多く、副腎が ACTH の刺激に より cortisol の産生を増加する機序や、クッシング症 候群を呈する副腎腺腫において, ACTH が抑制されて いるのにもかかわらず cortisol が自律的に分泌される 機序についても詳細には解明されていない. 副腎皮質
にはグルココルチコイド受容体8)の他エストロゲン受 容体9)10),アンドロゲン受容体11)12)が存在する事が報告 されているが, その作用機序については不明である.
さらに, guinea pig の副腎皮質の核には progester- one と特異的に結合する蛋白(P4-BP)が局在する事が 明らかにされてきたり). P4-BP は分子量50,000の蛋白3) で、プロゲステロン受容体(PR)に比べて解離定数が 10倍(親和性が10分の1)で,37℃でより安定であり, R5020との親和性が低 く,RU486(progesterone の antagonist) により progesterone との結合が抑制され ず, KCl などの塩により核から抽出されないなど, PR とは生化学的性状が異なっている1)、 また,PR に対す る抗体(PR 分子の N-末端を認識する抗体)では認識 されない事から P4-BP は PR とは異なる蛋白である と考えられてきた1). P4-BP は DNA に結合し,ACTH により増加する事からステロイド受容体と同様な転写 調節因子で,副腎皮質における steroidogenesis に関 与しているのではないかと推測されている2)3).
PR には分子量~94,000の A-receptor と 分子量 ~120,000の B-receptor が存在しているが,最近,完全 な PR 分子の N-末端が途中で切りとられ, DNA 結合 領域の一部とホルモン結合領域を有する分子量50,000 の新しいタイプの PR(C-receptor)が存在する事が PR の遺伝子解析から予測され13), progesterone の標 的臓器中にも微量ながら認められている. C-recptor は分子量からも,R5020との親和性が低い事からも guinea pig の P4-BP とよく似ている. PR の N-末端は PR 分子の標的遺伝子の特異的な活性化に関与してい る14)ので, P4-BP と classical な PR の作用が異なって いても, P4-BP が PR 分子の N-末端を欠損した C- receptor である可能性は否定できない. PR 分子の N- 末端を認識する抗体を用いたウェスタンブロッティン グの結果ではguinea pig 副腎皮質組織中に PR の存 在を認める事ができなかった1)が,今後, PR の C-末端 を認識する抗体を用いて同様の実験を行い, C- receptor が副腎組織中に存在するかどうか,また、そ れが P4-BP と同じ分子であるかどうか確認したいと 考えている.
P4-BP は現在まで調べられた範囲内では guinea pig 以外の正常副腎には発見されていない。 我々はヒ ト正常副腎組織中の progesterone 結合活性を測定し たが認められなかった. なぜ P4-BP が guinea pig の 正常副腎でのみ同定されるのかについては不明であ る。 しかし,我々はその考えられる要因として, guinea
pig の血中 cortisol がヒトの数倍高値である事14)に注 目した. ヒトにおいても血中 cortisol 値の高いクッシ ング症候群を呈する副腎腺腫では P4-BP が同定され るのではないかと推測して実験を行った. その結果, 5例のクッシング症候群を呈する副腎腺腫全例に P4- BP と同様の解離定数と特異性を有する progesterone 結合活性を認めた. しかし,その結合定数は guinea pig 副腎の P4-BP の約15分の1という低値であった. 一 方, Scatchard 解析では progesterone の高親和性結合 が認められなかった正常副腎についても TLC で分析 してみると核には〔3H〕progesterone が結合しており, それが1,000倍の非標識 progesterone により抑制され ていた. これらの事から,ヒト正常副腎においても guinea pig 副腎の P4-BP と同様なprogesterone 結合 活性が発現されているが,その量が微量なため,通常 行われている progesterone binding assay 法では同定 できないと考えられる.
Progesterone 結合活性はすべての副腎腫瘍組織で 発現されるわけではなく、副腎腫瘍であっても内分泌 非活性副腎腺腫やアルドステロン産生副腎腺腫中には progesterone 結合活性は認められなかった. この事 は, progesterone 結合活性が過剰な血中 cortisol の存 在下で発現される事を示唆している。 しかし, proges- terone 結合活性の発現が cortisol により誘導される のか,または逆にprogesterone 結合活性が発現される 事により副腎での steroidogenesis が亢進されるのか については不明である. また、ヒト副腎組織中の progesterone 結合活性は解離定数や結合特異性など から guinea pig 副腎皮質の P4-BP と同じ蛋白である と推測されるが,DNA との結合の有無や分子量の測 定など今後、検討しなければならない点も残されてい る. また,この蛋白が PR の C-receptor と同じ蛋白で あるかどうか解明する事は,PR の新しい機能の発見 という点からも興味深いと思われる.
文 献
1) Demura, T., Driscoll, W.J. and Strott, C.A. : Nuclear progesterone-binding protein in the guinea pig adrenal cortex : Distinction from the classical progesterone receptor. Endocrinology, 124, 2200-2207, 1989.
2) Demura, T., Driscoll, W.J. and Strott, C.A. : The nuclear conversion of pregnenolone to progesterone and subsequent binding to the nuclear progesterone-binding protein in the guinea pig adrenal cortex : A possible
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3) Demura, T., Driscoll, W.J., Lee, Y.C. and Strott, C.A .: Adrenocortical nuclear progesterone- binding protein : Identification by photoaffinity labeling and evidence for deoxyribonucleic acid binding and stimulation by adrenocor- ticotropin. Endocrinology, 128, 553-558, 1991.
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12) Rifka, S.M., Cutler, G.B. Jr., Sauer, M.A. and Loriaux, D.L .: Rat adrenal androgen rece- ptor : A possible mediator of androgen-induced decrease in rat adrenal weight. Endocrinology, 103, 1103-1110, 1978.
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14) Hodgson, A.J. and Funder, J.W .: Glucocor- ticoid receptors in the guinea pig. Am. J. Physiol., 235, R115-R120, 1978.
(1993年3月1日受理)