· 论著 ·
应用组织芯片技术研究 A103 和 inhibin α 在 肾上腺皮质肿瘤中的诊断价值
张红英 王晓洁 刘卫平 蒋莉莉 李甘地 郭嘉 张元亨
【摘要】 目的 研究肾上腺皮质肿瘤的免疫组织化学和临床病理特点及 A103 与 inhibin α 在其 中的诊断价值并探讨组织芯片技术的可行性。方法 制备肾上腺皮质腺瘤(ACA)、肾上腺皮质癌 (ACC)及嗜铬细胞瘤组织芯片各1个。肾上腺皮脂腺瘤芯片(79例),其中正常肾上腺皮质3例,胎 儿肾上腺皮质2例,肾上腺皮质结节状增生2例,ACA 72例;肾上腺皮质癌芯片(56例),其中ACC 39例,肾上腺转移肿瘤17例(恶性黑色素瘤4例,转移癌13例);嗜铬细胞瘤芯片(44例)中含肾上 腺髓质3例,嗜铬细胞瘤41 例;20 例正常成人肾上腺的常规石蜡组织作对照。用免疫组织化学 EnVision 法检测 A103、inhibin α、calretinin、Ki-67 等的表达情况。结果 A103 阳性表达情况分别为正 常肾上腺皮质 100%(23/23),胎儿肾上腺皮质 2/2,皮质增生2/2,ACA 90.9%(60/66),ACC 94. 6% (35/37),肾上腺髓质及嗜铬细胞瘤阴性,转移肿瘤中除恶性黑色素瘤 3/3 阳性外其余均为阴性; inhibin α 在正常肾上腺皮质、胎儿肾上腺皮质及皮质增生中100%表达,阳性部位主要在网状带与束 状带内层,ACA 阳性率 75.8%(50/66),ACC 75.7%(28/37),肾上腺髓质、嗜铬细胞瘤及转移肿瘤均 为阴性。结论 组织芯片技术为快速原位检测提供了强有力的手段。应用组织芯片技术大规模高效 检测组织样本是可行的。A103 及 inhibin α 的联合应用对于明确肾上腺皮质肿瘤的诊断与鉴别诊断 有较高价值。
【关键词】 肾上腺皮质肿瘤;腺瘤,肾上腺皮质;癌,肾上腺皮质;抑制素类
Diagnostic value of A103 and inhibin-a in adrenocortical tumors: an immunohistochemical study using tissue microarray techniques ZHANG Hong-ying ( Email : hongyingzh @ yahoo. com ) *, WANG Xiao-jie, LIU Wei-ping, JIANG Li-li, LI Gan-di, GUO Jia, ZHANG Yuan-heng. * Department of Pathology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
[ Abstract] Objective To investigate the potential diagnostic value of A103 and inhibin-a in adrenocortical tumors and to evaluate the applicability of tissue microarray/tissue chip in pathological studies using immunohistochemistry. Methods A tissue microarray/tissue chip was constructed to contain 179 formalin-fixed, paraffin-embedded adrenal tissue samples which include 3 normal adrenal cortex, 2 fetal adrenal cortex, 2 nodular adrenocortical hyperplasia samples, 72 adrenocortical adenomas,39 adrenocortical carcinomas, 3 adrenal medulla, 13 metastatic carcinomas, 4 metastatic malignant melanomas and 44 pheochromocytomas. Additional 20 cases of normal adult adrenal gland were used as controls. Immunohistochemical markers, including A103, inhibin-a, calretinin and Ki-67 were used on the tissue array sections by EnVision immunohistochemical staining methods. Results Positive staining of A103 was seen in all of the 23 ( 100% ) adrenal cortex, 2 fetal adrenal cortex, 2 nodular adrenocortical hyperplasia samples, 60 of 66 ( 90.9% ) adrenocortical adenomas samples, 35 of 37 ( 94.6% ) adrenocortical carcinomas samples, 3 of 3 malignant melanomas, but in none of the adrenal medulla, pheochromocytomas or adrenal metastatic carcinoma samples. In all of the adrenal cortex, fetal adrenal cortex and nodular adrenocortical hyperplasia cases, inhibin-a immunoreactivity was limited to the zona reticularis and the innermost zona fasciculata. Fifty of the 66 (75. 8% ) adrenocortical adenomas, 28 of the 37 (75. 7% ) adrenocortical carcinomas were positive for inhibin-a. None of the adrenal medulla, pheochromocytoma, metastatic malignant melanoma or carcinoma samples showed a positive inhibin-a immunostain. Conclusions
The tissue microarray/tissue chip technique provides a reliable method to investigate marker expression by offering a rapid, economic and accurate screening of tissue specimens on a large scale. The combined use of A103 and inhibin-a is valuable in distinguishing adrenocortical tumor from pheochromocytoma and other metastatic neoplasms.
[ Key words ] Adrenal cortex neoplasms; Adenoma, adrenal cortical; Carcinoma, adrenal cortical; Inhibins
组织芯片又称组织微阵列(tissue microarray), 是应用基因芯片概念而发展的方法,可在一张玻片 上一次性完成几百甚至上千例组织标本的基因扩 增、mRNA 转录及基因表达产物的分析[1]。组织芯 片具有高产出、实验误差小、省时、省力、节约经费等 特点,能用于科研、教学、生物试剂测试、质量监控及 标准化等领域[2]。肾上腺皮质肿瘤诊断有时很困 难。该类肿瘤主要包括肾上腺皮质腺瘤(ACA)和 肾上腺皮质癌(ACC)。ACA 及 ACC 尤其是 ACC 组 织学变异较大,其缺乏独立免疫表型,形态学不典型 且无功能时很难与其他肿瘤相鉴别。按单位重量计 算,肾上腺发生转移肿瘤的概率远远高于其他任何 器官,肾上腺常见的转移肿瘤有乳腺、肺、肾、胃肠、 胰腺、卵巢癌及恶性黑色素瘤等。嗜铬细胞瘤的形 态有时也与肾上腺皮质肿瘤相似。多年来,许多研 究者在寻求力图找到一种或一组有助于肾上腺皮质 肿瘤的诊断及鉴别诊断的免疫标记。近年来, Melan-A(克隆号 A103)、inhibin α 及 calretinin 等免 疫标记已开始引起人们的重视。我们应用肾上腺标 本的组织芯片及正常成人肾上腺的常规石蜡组织, 对肾上腺皮质肿瘤的免疫组织化学及临床病理进行 分析,进一步研究 A103、inhibin α 及 calretinin 等在 肾上腺皮质肿瘤中的诊断及鉴别诊断价值。
材料与方法
石
1. 材料来源:收集四川大学华西医院 1991 年 1 月~2001年12月间泌尿外科手术及尸体解剖肾 上腺标本共179例,制成3个组织芯片:(1)ACA 芯 片(79例),其中含正常肾上腺皮质3例(来自肾癌 根治术未受累之肾上腺),胎儿肾上腺皮质2例(来 自尸体解剖三期妊娠自然流产的胎儿),肾上腺皮 质结节状增生2例,ACA 72 例,腺瘤中伴 Cushing 综 合征(皮质醇增多症)者31例,伴 Conn 综合征(醛 固酮增多症)者25例,伴男性化者3例,无功能者 13例;(2)ACC 芯片(56例),其中 ACC 39 例(伴 Cushing 综合征者17 例,伴 Conn 综合征者8例,伴 男性化者4例,无功能者10例),肾上腺转移肿瘤 17例,其中包括恶性黑色素瘤4例,转移癌13例 (肾细胞癌4例,肝细胞癌3例,消化道低分化腺癌 2例,卵巢癌2例,肺腺癌、鳞癌各1例);(3)嗜铬细 胞瘤芯片(44例),其中正常肾上腺髓质3例(来自 肾癌根治术未受累之肾上腺),嗜铬细胞瘤41 例。
全部切片均经组织病理学确诊。另选20例正常成 人肾上腺(来自尸体解剖)的常规石蜡组织。
2. 组织处理:全部标本均用4%甲醛固定,行常 规组织处理,石蜡包埋,做5 μm厚组织切片,并进 行HE 染色,用于组织定位。
3. 组织芯片的制备:采用手工制作芯片。基本 方法参见本组已发表的文章[3]。
4. 免疫组织化学染色:采用 EnVision 法。第一 抗体为鼠抗人单克隆抗体 Melan-A(克隆号 A103)、 inhibin α、calretinin、HMB45、波形蛋白、AE1/AE3、 细胞角蛋白(CK,pan)、上皮膜抗原(EMA)、嗜铬粒 A(CgA)、突触素、Ki-67、S-100、神经元特异性烯醇 化酶(NSE)。除 A103 和 calretinin 为 Zymed 公司产 品外,其余一抗及 Envision 试剂盒均为 Dako 公司产 品。高压煮沸抗原修复。每片每次滴加工作稀释液 200 μl,DAB 显色,苏木精对比染色,用2.4~4.0cm 盖玻片封片。每个标记均设有阳性、阴性及空白对 照,其中阳性对照 A103 选用恶性黑色素瘤,inhibin α 用卵巢粒层细胞瘤,calretinin 用间皮瘤。阳性观察 标准:EMA(细胞膜)、Ki-67(细胞核)、calretinin[细 胞核和(或)细胞质]、其余抗体(细胞质)呈棕黄色 为阳性,阳性细胞 1%~25% 为+,26% ~50% 为 + +,51%~75%为+++,>76%为++++。
5. 统计学方法:采用x2 检验。
器资金结果
1. 组织芯片质量:制作阵列蜡块过程中无组织 芯脱落,组织芯片排列整齐。在组织芯片制备过程 中,ACA 芯片中 79例样本4 片组织缺失(5.1%), 2 片组织折叠(2.5%),实际有效样本为73例,占总 样本量的92.4%;ACC 芯片 56 例样本中2 片组织 缺失(3.6%),2片组织折叠(3.6%),实际有效样 本为52例,占总样本量的92.9%;嗜铬细胞瘤芯片 44 例样本中 2片组织缺失(4.5%),1 片组织折叠 (2.3%),实际有效样本为41例,占总样本量的 93.2%。具体情况见表 1。免疫组织化学染色过程 中无组织脱落。
2. 免疫组织化学染色结果:(1)A103(表1):组 织芯片及常规石蜡切片中的正常成人肾上腺皮质球 状带、束状带、网状带细胞质均显示弥漫强阳性,胎 儿肾上腺皮质及肾上腺皮质结节状增生均有相似表 达。表现为细胞质内出现粗细一致的棕黄色颗粒。
| 组织类型 | 有效样本/ 原始样本 | 阳性例数(率,%) | ||
|---|---|---|---|---|
| A103 | Inhibin &x | HMB45 | ||
| 肾上腺皮质 | 23/23 | 23(100) | 23(100) | 0 |
| 肾上腺皮质结节状增生 | 2/2 | 2 | 2 | 0 |
| 胎儿肾 上腺皮质 | 2/2 | 2 | 2 | 0 |
| 肾上腺皮质腺瘤 | 66/72 | 60(90.9) | 50(75.8) | 0 |
| 伴 Cushing 综合征 | 29/31 | 27(93.1) | 24(82.8) | 0 |
| 伴 Conn 综合征 | 23/25 | 20(87.0) | 16(69.6) | 0 |
| 伴男性化 | 3/3 | 3 | 3 | 0 |
| 无功能 | 11/13 | 10(90.9) | 7(63.6) | 0 |
| 肾上腺皮质癌 | 37/39 | 35(94.6) | 28(75.7) | 0 |
| 伴 Cushing 综合征 | 16/17 | 15(93.8) | 13(81.3) | 0 |
| 伴Com 综合征 | 8/8 | 8 | 6 | 0 |
| 伴男性化 | 4/4 | 4 | 4 | 0 |
| 无功能 | 9/10 | 8(88.9) | 5(62.5) | 0 |
| 转移癌 | 12/13 | 0 | 0 | 0 |
| 转移性恶性黑色素癌 | 3/4 | 3 | 0 | 3 |
| 肾上腺髓质 | 3/3 | 0 | 0 | 0 |
| 嗜铬细胞瘤 | 38/41 | 0 | 0 | 4(9.8) |
注:A103 肾上腺皮质腺瘤与嗜铬细胞瘤及转移癌相比,x2 值分 别为 103.28、79.97.P<0.05;肾上腺皮质癌与嗜络细胞瘤及转移 癌相比. x2 值分别为 89.45、66.95.P <0.05;inhibin α 肾上腺皮质 腺瘤与嗜铬细胞瘤及转移癌相比,x2 值分别为 89.70.97.35,P< 0.05;inhibin α 肾上腺皮质癌与嗜铬细胞瘤及转移癌相比,x2 值分 别为63.53.58.79.P<0.05
ACA 中 90.9%均为弥漫强阳性(图1),胞质呈颗粒 状的细胞及透明细胞均呈阳性。ACC 中94.6%呈 阳性(图2,3),其中77.1%为弥漫阳性,22.9%为局 灶阳性。不同功能的肾上腺皮质肿瘤之间及其与无 功能的肾上腺皮质肿瘤之间的差异无显著性意义 (P>0.05)。肾上腺髓质、嗜铬细胞瘤及转移癌均 为阴性。恶性黑色素瘤均为弥漫强阳性。(2) inhibin α 的免疫组织化学染色结果(表1):组织芯 片及常规石蜡切片中的正常成人肾上腺皮质、胎儿 肾上腺皮质及肾上腺皮质结节状增生中均有阳性表 达,髓质无表达(图4);ACA 中 75.8% 阳性(图5), 其中 76% 弥漫强阳性,24% 局灶阳性,ACC 中 75.7% 阳性(图6~8),其中46.4%为弥漫强阳性, 53.6%局灶阳性。阳性细胞主要为排列致密、胞质 嗜酸性与网状带相似的细胞,透明细胞为弱阳性或 阴性。肾上腺皮质肿瘤中伴男性化症状者阳性率最 高(ACA 100%, ACC 100%),其次为伴 Cushing 综 合征者(ACA 82.8%,ACC 81.3%),伴 Conn 综合 征(ACA 69.6%,ACC 75%)与无功能者(ACA
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阳性,内束状带弱阳性,其余各带阴性 EnVision 法 × 175 图5 肾上腺皮质腺瘤 inhibin α呈弥漫强阳性,阳性细胞主要为排列致密、 图6 肾上腺皮质癌,可见较多嗜酸性细胞 HE x 175 图7 与图6 为同一例,inhibin a 呈 胞质嗜酸性的细胞 EnVision 法 × 175 弥漫强阳性 EnVision 法 × 175 图8 与图6 为同一例,木中冷冻切片快速免疫组织化学染色,inhibin a呈阳性 葡聚糖聚合物法(I.DP) ×175
63.6%,ACC 62.5%)阳性率最低。除伴 Conn 综合 征的肿瘤与无功能肿瘤之间差异无显著性意义(P >0.05)外,其余各组之间差异均有显著性意义(P <0.05)。嗜铬细胞瘤、转移癌与恶性黑色素瘤均 为阴性。(3)其他标记:ACA 中仅有2例个别细胞 calretinin 呈灶性胞质弱阳性,ACC 均为阴性;所有 肾上腺皮质肿瘤 HMB45 均为阴性;ACA 突触素阴 性而 ACC 中有 10例(27.0%)有阳性表达;ACA、 ACC 中分别有20 例(30.3%)、23例(62.2%)表达 NSE;ACA、ACC 中分别有 36 例(54.5%)、4例 (10.8%)表达 AE1/AE3,37 例(56.1%)、2 例 (5.4%)表达CK(pan),6例(9.1%)、1例(2.7%) 表达EMA;S-100 均为阴性;Ki-67 阳性率平均值为 正常肾上腺(0.20 ±0.09)%,ACA(2.00 ± 0. 13)%,ACC(19.67±7.30)%,ACA与 ACC 相比 P<0.05。
讨 论
中华
肾上腺皮质肿瘤一直被认为缺乏独立的免疫表 型,典型的病例容易诊断。随着 B 超及CT 的广泛 应用,体检中常发现偶发性肾上腺皮质肿瘤而且多 无功能,形态学不典型时很难与隐匿性嗜铬细胞瘤、 肾细胞癌及其他转移性恶性肿瘤相鉴别。多年来与 肾上腺嗜铬细胞瘤及腹膜后副节瘤鉴别时病理学家 通常用的标记为 NSE、CgA、突触素,若 NSE、CgA、突 触素阳性则诊断为嗜铬细胞瘤,反之则倾向肾上腺 皮质肿瘤,采用的是排除法。肾上腺皮质肿瘤与转 移性癌的鉴别通常依赖于 EMA,后者 EMA 阳性而 前者常常阴性。随着免疫组织化学的广泛应用,逐 渐发现 NSE 具有较高的敏感性而特异性相对较差, 而肾上腺嗜铬细胞瘤和副节瘤有时 CgA 也会阴性。 更有研究者发现突触素的表达是肾上腺皮质肿瘤诊 断中的另一陷阱,认为 ACC 可具有神经内分泌功 能,Komminoth 等[4]在 ACC 及嗜铬细胞瘤中均检测 出突触素的蛋白及mRNA。转移性癌尤其是肾细胞 癌有时也不表达EMA,此时增加了诊断难度。曾有 学者报道过用D11 来鉴定肾上腺皮质细胞,但后来 发现它还可表达于其他上皮源性如肝、肺、肾细胞肿 瘤[5],使该抗体的使用受到限制。
Melan-A 即 MART-1 ( melanoma antigen recognized by T cell),是黑色素细胞特异抗原,表达 于黑色素细胞、视网膜及黑色素瘤细胞,它有2种克 隆号分别为 M2-7C10 和 A103,其与 HMB45 连用已 经被广泛地运用于黑色素细胞来源肿瘤的诊断及鉴
别诊断。Busam 等[6]报道了在肾上腺皮质与性腺 A103 呈阳性反应。我们用本室构建的肾上腺皮质 肿瘤组织芯片对 A103 在肾上腺皮质肿瘤中的表达 情况进行了较大规模的调查,ACA 90.9%,ACC 94.6% 阳性,提示 A103 可以用于肾上腺皮质肿瘤 的诊断及鉴别诊断。尽管在肾上腺皮质肿瘤中出现 阳性反应,却并不意味着 Melan-A 蛋白存在于肾上 腺皮质细胞中,因为 Melan-A 的另一单克隆抗体 M2-7C10 在肾上腺皮质肿瘤中为阴性[7],而且 Coulie 等[8]运用 PCR 技术在肾上腺皮质中未检测 出 Melan-A 的 mRNA。这些发现提示 A103 在肾上 腺皮质及皮质肿瘤中的阳性反应是一种交叉反应, 系非特异染色。正是这种恒定的交叉反应可用于诊 断肾上腺皮质肿瘤。A103 的阳性反应还可出现于 血管平滑肌脂肪瘤、淋巴管肌瘤病、透明细胞糖瘤等 血管周细胞来源的肿瘤和肾上腺外产生类固醇激素 的肿瘤如 Leydig 细胞瘤及粒层细胞瘤,但很少出现 于其他肾上腺外的上皮源性肿瘤。这更增加了 A103 在肾上腺皮质肿瘤中的诊断价值。
抑制素 inhibin 由 α 和 β 两个亚单位组成的二 聚体,相对分子质量是32 000,它是 TGFβ 家族成 员,具有抑制垂体促性腺激素尤其是 FSH 的分泌功 能。它存在于性腺组织内。inhibin α 通常被认为存 在于睾丸的 Sertoli 细胞和卵巢的粒层细胞中。有研 究者发现其尚可表达于性腺外组织,如胎盘、垂体、 肾上腺皮质[9]。曾有研究者发现肝细胞内也有 inhibin α 的表达,但后来发现在阻断内源性生物素 以后无表达。Arola 等[10]在肾上腺皮质中检测出 inhibin α 的 mRNA。我们运用组织芯片对其进行研 究发现它可表达于正常肾上腺皮质的网状带(强阳 性)、内束状带,而束状带外层及球状带阴性。肾上 腺皮质肿瘤表达可弥漫或较为局限,主要表达于较 致密与胞质嗜酸性的与网状带类似的细胞。 inhibin α 在肾上腺皮质肿瘤中的表达与其功能状 态的关系国外的研究结果不一致。McCluggage 等[11]认为二者无关,而另外一些研究则提示 inhibin α在伴有男性化和 Cushing 综合征时表达最 强,而伴发 Conn 综合征与无功能者表达相对较 低[12],与本研究结果一致。
Calretinin 最初是从鸡视网膜上的神经细胞分 离出来,已被证实存在于中枢及外周神经系统的神 经原中以及间皮细胞中(阳性表达为细胞核、细胞 质同时着色,呈“煎蛋”样)。Jorda 等[13] 发现 calretinin 在肾上腺皮质中也可有阳性表达,表现为
细胞质着色。本研究经过多次实验,calretinin 在 ACA 中仅有2例个别细胞呈灶性弱阳性而 ACC 全 部阴性,而阳性对照间皮瘤为强阳性。分析原因可 能与我们采用的是单克隆抗体而 Jorda 等采用的则 为多克隆抗体有关。目前有关 calretinin 在肾上腺 皮质中的表达情况的文章尚较少。因此,calretinin 是否能作为肾上腺皮质肿瘤的标记之一尚有待于进 一步研究。
多年来学者们一直在寻求有助于肾上腺皮质肿 瘤的诊断与鉴别诊断的免疫标记。A103 及inhibin α 对于该类肿瘤的确定起着重要的作用。需要注意的 是应根据具体情况与其他免疫标记如 NSE、CgA、突 触素、S-100、CK、EMA、HMB45 等联合应用,必要时 加做如肾细胞及肝细胞等组织特异性标记。值得注 意的是当 inhibin α 阴性而A103 阳性时应与恶性黑 色素瘤相鉴别,此时应补做标记 HMB45 与 S-100, 若为阴性应诊断为肾上腺皮质肿瘤,反之则诊断为 恶性黑色素瘤。血管周细胞来源的肿瘤也表达 A103,但形态学与肾上腺皮质肿瘤差异较大,而且 该类肿瘤 inhibin α 阴性、HMB45 阳性可予鉴别。卵 巢粒层细胞瘤和睾丸 Sertoli 细胞瘤可同时表达 A103 和 inhibin α,所幸的是它们在组织形态上与肾 上腺皮质肿瘤差异较大,而且常常表达CD99。随着 术中冷冻切片免疫组织化学染色的开展,A103 和 inhibin α 有了更为广大的应用空间(图8)。
A103 和 inhibin α 在 ACA 与 ACC 中表达差异 无显著意义。多年来肾上腺皮质肿瘤良恶性鉴别即 使对经验丰富的病理学家来说也是一个挑战。国内 外许多学者均有各自不同的标准。目前得到大家公 认的是1984 年 Weiss[14]提出的 9 个特点:(1)核异 型性的大小;(2)核分裂象>5个/50HPF;(3)出现 不典型核分裂象;(4)细胞质嗜酸性的肿瘤细胞 ≥75%;(5)肿瘤细胞呈弥漫分布;(6)坏死;(7)静 脉侵犯;(8)窦隙状侵犯;(9)包膜浸润。以上条件 满足3 条或4 条以上则应考虑为恶性。1989年 Weiss 等[15]提出了将核分裂象≥20/50HPF 作为预 后最差的指标。Terzolo 等[16] 提出将Ki-67 作为鉴 别 ACA 与 ACC、判断预后的一个重要辅助指标。因 为核分裂指数有一定弊病,HE 染色下染色质浓染 的细胞可能为死亡的细胞,它们可能与固定不及时 有关。Ki-67 能识别细胞周期中非 Go 期的细胞,而 核分裂仅出现于 G2-M期。细胞核分裂获得的信息 比Ki-67 少,而且易受到样本偏倚的影响。Ki-67 染 色的可重复性较好,阳性染色易于辨认。因此,现在
有病理学家及泌尿外科学家极力推荐将其作为判断 良恶性及预后的重要参考指标之一。但具体参考值 尚未统一,须加大病例量做进一步研究以确定良性、 恶性及高恶性的Ki-67 阳性率参考值,决定是否在 根治术后加放疗等辅助治疗。
参 考 文 献
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2 Kallioniemi OP, Wagner U, Kononen J, et al. Tissue microarray technology for high-throughput molecular profiling of cancer. Hum Mol Genet, 2001, 10: 657-662.
3 刘卫平,张红英,郭嘉,等.组织芯片技术及其在病理学研究中的 初步应用. 中华病理学杂志,2001,31:179-180.
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(收稿日期:2003-05-13)
(本文编辑:齐文安)