· 论著 ·
肾上腺髓质素在肾上腺疾病中的 免疫组化研究
卢琳 曾正陪 杨堤 陈杰 李明
【摘要】目的 应用免疫组织化学技术观察免疫反应性肾上腺髓质素(ir-ADM)在人正常肾上 腺、良恶性肾上腺肿瘤及肾上腺皮质增生组织中的分布特点。方法 对人正常肾上腺皮质(n=10) 和髓质(n=10)、嗜铬细胞瘤(n=31)、原发性醛固酮增多症的肾上腺皮质腺瘤(n=13)和增生(n= 9)、皮质醇增多症的肾上腺皮质腺瘤(n=12)、增生(n=10)和腺癌(n=4)、无功能肾上腺皮质腺癌 组织(n=7)进行 ir-ADM 的免疫组化染色。结果 10例人正常肾上腺髓质组织均显示 ir-ADM 染色 阳性;31 例嗜铬细胞瘤组织中16例染色阳性,大部分嗜铬细胞瘤组织中的 ir-ADM 免疫组化染色强 度低于正常肾上腺髓质组织(P<0.01)。在嗜铬细胞瘤中阵发性高血压组阳性染色例数多于持续性 高血压组(P<0.05);人正常肾上腺皮质及各组皮质病变组织中,ir-ADM 免疫组化染色均为阴性。结 论 ir-ADM 在嗜铬细胞瘤组织中分布呈不均一性,可能与嗜铬细胞瘤患者血压表现的多样化有关, 应进一步探讨 ADM 在嗜铬细胞瘤发病中的病理生理作用。
【关键词】 肾上腺疾病; 免疫组织化学; 肾上腺髓质素
Immunohistochemical identification of adrenomedullin in adrenal diseases LU Lin, ZENG Zheng- pei* , YANG Di , CHEN Jie, LI Ming. * Department of Endocrinology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100730, China
[ Abstract ] Objective Adrenomedullin ( ADM) is a hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma tissue. In order to identify the pathophysiological effects of ADM on the etiology of adrenal diseases which can induce hypertension, the localization of immunoreactive adrenomedullin ( ir- ADM ) in adrenal tissue of subjects with normal adrenal and patients with different adrenal diseases was investigated by means of immunohistochemical staining. Methods Peroxidase anti-peroxidase complex method was undertaken in the tissue of human adrenal cortex ( n =10 ) and medulla ( n = 10 )of subjects with normal adrenal, as well as in the tissue of pheochromocytoma ( n = 31 ), primary aldosteronism including adrenocortical adenoma ( n = 13 ) and hyperplasia ( n =9 ), Cushing’s syndrome including adrenocortical adenoma ( n = 12 ), hyperplasia ( n = 10 ), carcinoma ( n =4 ) and non-functional adrenocortical carcinoma ( n =7). Results Positive immunohistochemical staining of ir-ADM was observed in all the cases of normal adrenal medulla and 16 of the 31 cases of pheochromocytoma. The intensity of immunohistochemical staining of ir-ADM in the majority of pheochromocytoma was lower than that in normal adrenal medulla ( P <0. 01 ). The number of pheochromocytoma cases with positive staining in paroxysmal hypertensive group was higher than that in sustained hypertensive group ( P <0. 05 ). Negative immunohistochemical staining was found in all the cases of normal human adrenal cortex, adrenocortical adenoma, hyperplasia and carcinoma. Conclusion It is suggested that heterogeneous of localization of ir-ADM in pheochromocytoma tissue may be correlated to the diversity of blood pressure in patients with pheochromocytoma . The pathophysiological effects of ADM on the etiology of pheochromocytoma should be further investigated.
[ Key words ] Adrenal gland disease; Immunohistochemistry; Adrenomedullin
肾上腺髓质素(ADM)是 1993年日本学者 Kitamura 等 从手术切除的以分泌去甲肾上腺素
(NE)为主的嗜铬细胞瘤提取液中分离出的一种 52 个氨基酸的多肽,它具有舒张血管、降低血压、扩张 支气管等多种生理作用。近年的研究还发现 ADM 可能参与了血压调节,但有关 ADM 在由肾上腺疾 病引起的高血压,特别是在嗜铬细胞瘤发病中的作 用及病理生理机制研究较少。有研究报道应用放射
免疫法测定嗜铬细胞瘤组织中 ADM的含量约为肾
上腺髓质的210 倍[1,2],而 Satoh 等[3]应用相同方
法,增加了样本数,其结果为人正常肾上腺组织(包
括皮质和髓质,n=7 )ir-ADM 的含量为(12.6±1.0)
fmol/mg 湿重组织;而嗜铬细胞瘤组织中(n=11)5
例测定值接近 0,5 例测定值在 010 fmol/mg 湿重
组织之间,仅1 例测定值大于 10 fmol/mg 湿重组
织。以上研究提示 ADM 在嗜铬细胞瘤组织中的含
量差异较大,但其影响因素尚未明确。本实验通过
观察较大样本、增加疾病种类用免疫组织化学染色
技术观察 ir-ADM 在人正常肾上腺髓质、嗜铬细胞
瘤、肾上腺皮质腺瘤、皮质增生及皮质腺癌组织中的
分布特点,为研究 ADM 与肾上腺疾病的关系提供
免疫组织化学方面的证据。
资料与方法
一、组织
96 份标本为北京协和医院病理科 1988 年1月 至1999年3月保存的常规石蜡包埋组织块,来自于 96 例病人,其中嗜铬细胞瘤31份;原发性醛固酮增 多症(原醛症)的肾上腺皮质腺瘤13份、皮质增生 9 份;库欣综合征的肾上腺皮质腺瘤12份、皮质增生 10 份和皮质腺癌4份;无功能肾上腺皮质腺癌7 份;将肾癌根治术时切除并经病理证实为正常的 10 例肾上腺作为对照。
二、抗体
兔抗人 ADM(1-52)抗体(Peptide Institute, Osaka,Japan),由日本东京女子医科大学内分泌研 究所赠送,羊抗兔抗体(二抗)、过氧化物酶抗过氧 化物酶复合物(三抗)购自 Dako 公司。
三、免疫组织化学染色
采用过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法[4] (PAP法)。切片厚4 μm,65℃烤片1h,二甲苯脱 蜡,3%过氧化氢乙醇封闭内源性过氧化物酶活性后 置枸橼酸缓冲液中(pH 6.0),微波修复抗原 10 min (600W),兔抗人 ADM-Ab(稀释度为 1:500)4℃孵 育 20 h。加二抗和三抗后分别在室温下孵育 30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色5~10 min,苏木素 复染胞核。各步间均用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗。每例组织重复染色3次。
对照实验:阳性对照(正常肾上腺髓质),阴性 对照(PBS 代替一抗)。
四、结果判断标准
1. 阳性标准:在高倍视野下,细胞胞浆内出现
棕黄色颗粒为阳性细胞。
2. 阳性分级5]:在高倍视野下选取100个细 胞,计数阳性细胞百分比,随机选取3个视野,每个 视野计数3 次后取平均值。弱阳性(±):阳性细胞 数<5%;阳性(+):阳性细胞数 5% ~< 25%;中度 阳性(+ + ):阳性细胞数 25% ~< 50%;强阳性 (+ + +):阳性细胞数≥50%。
五、统计学分析
采用四格表确切概率计算法,P<0.05 为差异 有显著性。
结果
一、正常肾上腺及嗜铬细胞瘤组织中 ir-ADM 的
| 组织 | 份数 | 阳性细胞染色分级(例数) | 阳性 比例 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| - | 依 | 垣 | + + | + + + | |||
| 正常肾上腺皮质 | 10 | 10 | 园 | 园 | 园 | 园 | 0/10 |
| 正常肾上腺髓质 | 10 | 0 | 园 | 园 | 苑 | 猿 | 10/10 |
| 嗜铬 各细胞瘤 | 31 | 15 | 6 | 6 | 1 | 猿 | 16/31 |
注:正常肾上腺髓质组织与嗜铬细胞瘤组织比较,x2 =20.93, P<0. 01
正常肾上腺髓质组织 ir-ADM 染色均为阳性,相 应肾上腺皮质染色均为阴性;而在嗜铬细胞瘤组织 中,51.6%(16/31)染色阳性,大部分嗜铬细胞瘤组 织 ir-ADM 染色强度低于正常肾上腺髓质,差异有显 著性(P<0.01),见图 1,2。
二、临床特点不同的嗜铬细胞瘤组织中 ir-ADM 的分布特征(表2)
ir-ADM 在嗜铬细胞瘤组织中分布差异性较大, 既有阴性,也有强阳性。结合临床特点,按肿瘤的良 恶性、部位、数目、血压特点和儿茶酚胺(CA)特点进 行分组,对 ADM 在嗜铬细胞瘤中的分布情况进行 分析,结果显示与持续性高血压组相比,阵发性高血 压组嗜铬细胞瘤组织阳性染色例数较多(P< 0.05);在肾上腺内、外,良、恶性,单发、多发和分泌 CA 特点不同的各组嗜铬细胞瘤之间 ir-ADM 免疫 组化染色结果无显著差异。
三、肾上腺皮质病变组织中 ir-ADM 的分布
在原醛症的13 例肾上腺皮质腺瘤、9 例皮质增 生,库欣综合征的12例肾上腺皮质腺瘤、10例皮质
| 临床分类 | 例数 | ± ~ + + 原 (例) (例) | 染色阳性 比例 | |
|---|---|---|---|---|
| 肿瘤性质 | ||||
| 良性 | 21 | 10 | 11 | 11/21 |
| 恶性 | 10 | 缘 | 缘 | 5/10 |
| 肿瘤部位 | ||||
| 肾上腺内 | 15 | 苑 | 愿 | 8/15 |
| 肾上腺外* | 17 | 怨 | 愿 | 8/17 |
| 肿瘤数目 | ||||
| 单发 | 26 | 12 | 14 | 14/26 |
| 多发 | 缘 | 猿 | 圆 | 2/5 |
| 血压类型 | ||||
| 阵发性高血压 | 11 | 猿 | 愿 | 8/11 |
| 持续性高血压 | 11 | 愿 猿 | 3/11 | |
| 血压正常 | 怨 | 源 缘 | 5/9 | |
| 儿茶酚胺分泌特点 * * | ||||
| 分泌肾上腺素为主 | 12 | 愿 | 4 | 4/12 |
| 分泌去甲肾上腺素为主 | 愿 | 圆 6 | 6/8 | |
| 儿茶酚胺正常 | 源 | 员 3 | 3/4 | |
注:阵发性高血压组与持续性高血压组比较,x2=4.55,P < 0.05 ;* 有1例为混合型多发性内分泌腺瘤(MEN),同时选取了肾上 腺内及腹主动脉旁肿瘤组织 ;** 有6例患者未进行24h尿 CA 的检 测,1例患者仅有 24h尿 3-甲氧-4 羟苦杏仁酸(VMA)结果,故7例 患者未进行统计。以分泌肾上腺素(E)或 NE 为主的分类标准:将 所测 NE 和 E 的数值分别与其正常值上限相比得出增高倍数,倍数 增高明显者是分泌为主的激素
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增生和4例腺癌,7 例无功能肾上腺皮质腺癌组织 中 ir-ADM 染色均为阴性。
讨 论
一、正常肾上腺髓质、嗜铬细胞瘤组织中 ir-ADM的分布特点
虽然 ADM 是在嗜铬细胞瘤组织中发现的一种 多肽,但它在嗜铬细胞瘤组织中的含量有很大的差 异性(1,2],甚至有的嗜铬细胞瘤组织中的 ADM 含量 还低于正常肾上腺组织[3]。Letizia 等[6]报道在嗜铬 细胞瘤组织(n=10)周围的肾上腺髓质细胞中 ir-ADM的免疫组化染色为阳性,而嗜铬细胞瘤组织 中仅有散在的肿瘤细胞染色阳性。本研究通过进一 步增加样本数后,显示 ir-ADM 在嗜铬细胞瘤组织中 分布差异性较大,在31例嗜铬细胞瘤组织中,15例 为阴性,12例为弱阳性~阳性,仅有4例为中度阳 性至强阳性,而正常肾上腺髓质组织(n=10)中 ir-ADM染色均为中度阳性以上,提示 ADM 在正常 肾上腺髓质的分布是均一的,但在嗜铬细胞瘤组织 中的分布是不均一的。Liu 等[7]应用 Northern blot 法检测 ADM mRNA,发现在嗜铬细胞瘤(n=16)和 正常肾上腺髓质组织(n=5)中均有较高的表达,而 且在嗜铬细胞瘤组织中高于正常肾上腺髓质组织, 而本实验用免疫组化的方法显示,在大部分嗜铬细 胞瘤组织 ir-ADM 分布较少,提示在嗜铬细胞瘤组织 中 ADM的合成或代谢过程可能发生了改变,而导 致ir-ADM在嗜铬细胞瘤组织中的分布呈不均一性。
为探讨 ir-ADM 在嗜铬细胞瘤组织中分布差异 性较大的原因,我们将嗜铬细胞瘤从肿瘤性质、部 位、数目、血压类型以及CA 分泌的特点等方面进行 综合分析,结果初步表明 ir-ADM 在阵发性高血压组 的阳性染色例数多于持续性高血压组(P<0.05)。 Nishikimi 等[8]对2 例阵发性高血压的嗜铬细胞瘤 患者血浆 ir-ADM 和 CA 浓度检测结果表明,在血压 正常时,血浆 ir-ADM 浓度与正常人无差异,而血浆 CA 浓度明显升高;高血压发作时,血浆 ir-ADM 的 浓度无明显升高,但血浆CA 较静息状态下有进一 步的升高。有研究表明,在 Ca2+存在的情况下,用 卡巴胆碱作用于体外培养的牛肾上腺髓质细胞上的 烟碱受体,可引起 ADM和 CA 等比例协同释放[9]。 上述实验提示在嗜铬细胞瘤阵发性释放 CA时,可 能 ADM 并未随之等比例地释放。结合本实验结 果,推测当 CA 持续释放入血,临床表现为持续性高 血压时,ADM 亦随之持续释放入血,故瘤组织中残
留 ADM 较少,但分泌入血的 ADM 与 CA 之间比例 失调,临床仍表现为高血压;在阵发性高血压型嗜铬 细胞瘤患者如肿瘤组织中有较多的 ADM 与 CA 作 用相互拮抗时,可维持血压正常,当某种诱因使 CA 大量释放入血,而ADM 不能在短时间内等比例释 放入血时,则导致高血压发作,此时存留在嗜铬细胞 瘤组织中的 ir-ADM 较多而呈现免疫组化阳性染色, 但应进一步通过同时测定血中 ADM 的浓度来明 确。由于嗜铬细胞瘤患者的临床表现复杂多变,一 般认为与 CA释放的不同类型有关,有研究显示在 以分泌 NE 为主(≥10倍正常值)的嗜铬细胞瘤临 床表现多为持续性高血压[6],本实验在以分泌肾上 腺素为主的嗜铬细胞瘤中(n=12),7例表现为阵发 性高血压,5例为持续性高血压。其中7例表现为 阵发性高血压的组织中,4例 ir-ADM染色阳性,仅1 例为弱阳性;而5例表现为持续性高血压的组织中, ir-ADM 染色均为阴性。在以分泌 NE 为主的嗜铬 细胞瘤中(n=8),5例表现为持续性高血压,3例为 阵发性高血压。在5例表现为持续性高血压的病例 中,3例染色阳性,其中2例为弱阳性;而3 例表现 为阵发性高血压的组织均为阳性。这一结果提示在 以分泌肾上腺素为主的嗜铬细胞瘤中,ir-ADM 染色 阳性的病例倾向于表现为阵发性高血压。本研究又 将ir-ADM染色强度与24h尿 CA 之间进行相关回归 分析,但结果显示两者之间无明显相关,可能与有 24h 尿 CA 结果的病例数偏少有关。Letizia 等[6]报 道嗜铬细胞瘤患者(n =10)血浆中 ADM 的浓度明 显高于原发性高血压患者(n=16)及正常人(n= 21),并与 NE 浓度呈正相关。结合本实验结果,推 测 ADM 可能与 NE 协同释放入血增加,故当嗜铬细 胞瘤分泌 NE 较多时,临床表现为持续性高血压,血 浆中ir-ADM浓度升高,而瘤组织中存留 ADM 减少。 综上所述,ADM 可能参与了嗜铬细胞瘤血压的调 节,但其机制尚不明确,需要进一步深入研究。
二、肾上腺皮质疾病组织中 ir-ADM 的分布特点
医
本实验显示,在正常肾上腺皮质及不同肾上腺 皮质病变组织中 ir-ADM 的免疫组化染色结果为阴 性,与 Satoh 等[3]的实验结果相似。体外细胞培养 结果证实,ADM 对醛固酮瘤细胞分泌醛固酮、人肾 上腺皮质细胞分泌皮质醇[10]均无作用,结合本实验 结果,说明 ADM 对肾上腺皮质激素分泌无调节作 用。
本研究初步表明,ir-ADM 在嗜铬细胞瘤组织中 分布的不均一性可能与嗜铬细胞瘤不同血压类型有 关,但需要进一步从分子和受体水平上予以证实。
参 考 文 献
1 Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, et al. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromacytoma. Biochem Biophys Res Commun, 1993, 192: 553-560.
2 Ichiki Y, Kitamura K, Kangawa K, et al. Distribution and characterization of immunoreactive adrenomedullin in human tissue and plasma. FEBS Lett, 1994, 338 : 6-10.
3 Satoh F, Takahashi K, Murakami O, et al. Immunoreactive adrenomedullin in human adrenal glands and adrenal tumors. Cancer Detect Prev , 1997, 21 : 51-54.
4 杨景山,主编. 医学细胞化学及生物学技术. 北京:北京医科大 学中国协和医科大学联合出版社,1990.100-104.
5 皋兰湘,丁华野,邓永江,等. 乳腺癌组织中 bcl-2,p53 和 c-erB2 蛋白表达的相互关系及意义. 中华病理学杂志,1996,25:165- 168.
6 Letizia C, De Toma G, Caliumi C, et al. Plasma adrenomedullin concentrations in patients with adrenal pheochromocytoma. Horm Metab Res, 2001, 33: 290-294.
7 Liu J, Kahri AI, Heikkila P, et al. Adrenomedullin gene expression and its different regulation in human adrenocortical and medullary tumors. J Endocrinol, 1997, 155: 483-490.
8 Nishikimi T, Kitamura K, Saito Y, et al. Clinical studies on the sites of production and clearance of circulating adrenomedullin in human subjects. Hypertension, 1994, 24: 600-604.
9 Katoh F, Niina H, Kitamura K, et al. Ca ( 2 + )-dependent cosecretion of adrenomedullin and catecholamines mediated by nicotinic receptors in bovine cultured adrenal medullary cells. FEBS Lett, 1994, 348 :61-64.
10 Adreis PG, Neri G, Prayer-Galetti T, et al. Effects of adrenomedullin on the human adrenal glands: an in vitro study. J Clin Endocrinol Metab, 1997, 82: 1167-1170.
(收稿日期:2002-02-08) (本文编辑:侯鉴君)
全国第六届脑血管疾病学术会议征文通知
中华医学会神经病学分会拟于2003年第四季度在福州召开全国第六届脑血管疾病学术会议。征文内容:(1)脑血管疾 病的发病机制及危险因素;(2)脑血管疾病的基础研究(病理、生化、遗传);(3)脑血管疾病的治疗(内科用药,血管内介入,外 科)和预防;(4)脑血管疾病的康复等相关内容。来稿请寄1 000 字摘要及全文各1篇。摘要内容包括目的、方法、结果、结论 等四部分。楷字工整写清工作单位、姓名及邮编。加盖公章。截稿日期为2003年6月30日,会议具体时间和地点另行通知。 不录取稿件恕不退稿。论文请寄北京东单大华路1号卫生部北京医院神经内科,蔡晓杰收,邮编100730。信件上请注明“脑 血管疾病”字样。